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In einem Dampfsterilisator kondensiert der gesättigte heiße Dampf, wenn er mit einem kühleren Objekt, das sterilisiert werden soll, in Kontakt kommt. Die freigesetzte Wärme wird von diesem Objekt absorbiert. Dies führt zur Denaturierung der Keime, da die Molekularstruktur ihres Proteins zerstört wird. Zwar kann auch trockene Hitze zur Sterilisierung eingesetzt werden, aber feuchter Dampf eignet sich besser für diese Anwendung, da dieser Prozess mit niedrigeren Temperaturen und kürzeren Sterilisationszeiten auskommt.
Der Sterilisationsprozess wird durch biochemische und physikalische Parameter bestimmt. Seine Wirksamkeit lässt sich mit Hilfe von Experimenten bestimmen, d. h. durch einen Vergleich der Keimanzahl vor und nach dem Sterilisationsprozess.